完整RNA 的提取和純化,是進(jìn)行RNA 方面的研究工作,如Nothern雜交、mRNA 分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有RNA的提取過程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),即1):樣品細(xì)胞或組織的有效破碎;2),有效地使核蛋白復(fù)合體變性;3),對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制;4)有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離;5),對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶活性。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑,1),提取總核酸,再用氯化鋰將RNA 沉淀出來;2),直接在酸性條件下抽提,酸性下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA 留在水相。第一種提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA 的丟失,目前該方法的使用頻率已很低。
方法一:總RNA 的試劑盒快速提取
一些公司推出的總RNA 提取試劑盒,可以用來制備高質(zhì)量的可用于建庫(kù)的RNA 。該總RNA 純化系統(tǒng)采用兩種著名的RNA 酶抑制劑,異硫氰酸弧(GTC)和β-巰基乙醇,加上整個(gè)操作都在冰浴下進(jìn)行,這樣就能顯著降低RNA 的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用,將促使核蛋白復(fù)合體的解離,使RNA 與蛋白質(zhì)分離,并將RNA 釋放到溶液中。而進(jìn)一步從復(fù)合體中純化RNA ,則根據(jù)Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進(jìn)行,采用酸性酚-*混合液抽提。低pH值的酚將使RNA 進(jìn)入水相,這樣使其與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。水相中的RNA 可用異丙醇沉淀濃縮。進(jìn)一步將上述RNA 沉淀復(fù)溶于GTC溶液中,接著用異丙醇進(jìn)行二次沉淀,隨后用乙醇洗滌沉淀,即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽,而RNA 中如含無機(jī)鹽,則有可能對(duì)以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。
一:儀器
恒溫水浴,冷凍高速離心機(jī),紫外分光光度計(jì),取液器,電泳儀,電泳槽。
二:試劑
RNA 提取試劑盒,0.05%焦*(DEPC),75%乙醇
操作步驟
(一):細(xì)胞或組織破碎
A:微生物材料
1:發(fā)酵3-4天(或?qū)?shù)生長(zhǎng)期)的菌體,離心收集菌絲體(動(dòng)植物材料無需此步處理)
2:用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體2-3次,并盡量除去殘存的水
3:加液氮充分研磨,使其成為粉末,以釋放RNA
4:研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至12ml變性液的容器中勻漿。
B:動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)材料 (適用的樣品量為細(xì)胞:108)
1:細(xì)胞或組織培養(yǎng):按常規(guī)方法進(jìn)行
2:深層懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的破碎:
(1)細(xì)胞收集:含一定濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液置于無菌離心管中,4℃,3000g離心5分鐘
(2)細(xì)胞洗滌:上步沉淀用25毫升滅菌后冰凍的1×PBS緩沖液洗滌,然后4℃,3000g離心5分鐘,
(3)細(xì)胞破碎:在沉淀細(xì)胞中加入15毫升預(yù)冷的變性液,用無菌處理過的勻漿器勻漿
3:表面培養(yǎng)細(xì)胞的破碎:
(1)確定培養(yǎng)瓶數(shù)量,使選定的各培養(yǎng)瓶細(xì)胞累加后總量達(dá)108
(2)細(xì)胞收集:將培養(yǎng)液倒掉,用預(yù)冷的無菌PBS緩沖液洗滌一次,在培養(yǎng)瓶中加入8毫升預(yù)冷變性液,轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞溶解,此時(shí)可見粘度加大。
(3)用無菌吸管將第一個(gè)培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個(gè)培養(yǎng)瓶,旋轉(zhuǎn),溶解細(xì)胞,再吸入第三個(gè)培養(yǎng)瓶,以此類推,直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次,然后從第一個(gè)培養(yǎng)瓶開始再加入4毫升上述變性液,將所有培養(yǎng)瓶洗一次。
(4)將上述12毫升含細(xì)胞的變性液轉(zhuǎn)移至一50毫升無菌離心管中,勻漿破碎細(xì)胞。
C:植物組織破碎 (適用的樣品量為0.05g組織)
(1)將600ul變性液置于1.5ml離心管中,將此離心管放于冰浴中5分鐘。
(2)將0.05g新鮮組織用液氮冰凍
(3)在液氮下,研磨組織塊
(4)待液氮揮發(fā)后,將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。
D:動(dòng)物組織破碎 (適用的樣品量為1克組織)
(1)將12毫升變性液置于50毫升離心管中,將此離心管放于冰浴中5分鐘。
(2)在上述管中加入1克新鮮或冰凍動(dòng)物組織,勻漿粉碎。
注1:研磨組織塊用于RNA 提取的樣品,必須是新鮮的細(xì)胞或組織,如采樣后,不能立即用于提取則樣品應(yīng)用液氮速凍并貯于-70℃的冰箱中保存。
2:變性液及相應(yīng)的離心管需預(yù)冷。
(二):RNA 的抽提
在經(jīng)變性液勻漿的細(xì)胞或組織600ul+60ulpH4.0的2M乙酸鈉混勻,可用漩渦振蕩器。
600ul酚\*\*(25\24\1),混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。
冰裕中10-15分鐘,離心,4℃,10000g,20分鐘。
上層水相吸至無菌離心管中+等體積的異丙醇,-70℃,30分鐘沉淀RNA。
離心4℃,10000g,20分鐘。
沉淀RNA ,冷凍干燥15分鐘 , RNA 沉淀重新溶于300ul變性液中,可振蕩(有時(shí)為了幫助溶解,可在65℃加熱,但時(shí)間應(yīng)極短)。
60ulpH4.0的2M乙酸鈉混勻,可用漩渦振蕩器。
600ul酚\*\*(25\24\1),混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。
冰裕中10-15分鐘,離心,4℃,10000g,20分鐘。
上層水相吸至無菌離心管中。
等體積異丙醇二次沉淀(-70℃,30分鐘),75%乙醇洗沉淀,沉淀冷凍干燥,復(fù)溶于去RNA 酶的水中(對(duì)于準(zhǔn)備長(zhǎng)期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25M,再加入2.5體積的乙醇,-70℃保存。)
注:1變性液組成:25g異硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM pH4.0乙酸鈉、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2mM β-巰基乙醇),65℃溶解,過濾滅菌,4℃預(yù)冷。
2酸性酚配制:55℃時(shí),500g酚溶入500ml50mM,pH4.0乙酸鈉,混勻,靜止分層后,去上清,再反復(fù)加500ml50mM,pH4.0乙酸鈉,直到pH<4.1。
方法二: 氯化鋰法提取總RNA
本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA 酶,用氯化鋰選擇沉淀RNA ,其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA ,具有快速簡(jiǎn)潔的長(zhǎng)處,但也存在少量DNA的污染及RNA 得率不高,小RNA 片斷丟失的缺陷。
儀器: 同上
試劑:
氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L,過濾滅菌】
懸浮液【10mM Tris-HCL (pH7.6) ,1mM EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】
其余同上
操作步驟:
1:對(duì)于大量組織或細(xì)胞,則每克組織或細(xì)胞加入5-10ml氯化鋰-尿素溶液,勻槳器高速勻槳2分鐘;對(duì)于少量細(xì)胞(107個(gè)細(xì)胞/ml),則每克組織或細(xì)胞加入0.5ml氯化鋰-尿素溶液手工勻槳,并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中
2:勻槳液在0-4℃放置4小時(shí)后,12000g離心30分鐘
3:取沉淀,加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰-尿素溶液,重復(fù)步驟2
4:沉淀用原勻槳液1/2體積的氯化鋰-尿素溶液復(fù)溶后,加入等體積酚/*/*在室溫放置15-30分鐘并不時(shí)搖動(dòng)混勻,4000g離心5分鐘
5:取上層水相,加1/10倍體積的3M乙酸鈉(pH5.2)及2倍體積的乙醇,-20℃放置1小時(shí),5000g離心。
6:70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
7:RNA 溶解液溶解沉淀,得RNA ,分裝,于-70℃保存。